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      細菌內毒素檢中常見干擾的處理

      獸藥資訊 2021-10-25 10:49:26

      細菌內毒素檢中常見干擾的處理


      細菌內毒素(Endotoxin),是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,當細菌死亡或自溶后便會釋放出內毒素。細菌內毒素的主要化學成分為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),單體的分子量為5 000~25 000道爾頓,是由親水性的多糖O抗原、核心多糖和親脂性的類脂A(lipid A)共同構成的一種兩性大分子。脂多糖在極性溶劑和非極性溶劑中均能形成多聚體。


      細菌內毒素通過消化道進入動物體內時并不產生危害,小量入血后被肝臟枯否細胞滅活,不造成機體損害。但通過注射等方式大量進入血液時,作為外源性致熱原,它可激活中性粒細胞等使之釋放出內源性熱原質,作用于體溫調節中樞而引起發熱、寒顫、嘔吐等癥狀,嚴重者可致休克甚至死亡(熱原反應)。因此,生物制品類、注射用藥劑、抗生素類、疫苗等制劑以及醫療器材類必須經過細菌內毒素檢驗合格后才能使用。


      ? ? ? ? 細菌內毒素檢查法(也稱鱟試驗法)是利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產生的細菌內毒素,以判斷藥品或疫苗中內毒素的含量是否符合相關規定的一種方法,常用的方法有凝膠法和光度法。鱟試驗因其具有靈敏、快速、重現性好、可定量測試等優點,已逐步替代家兔法,廣泛用于制藥、臨床以及科研等領域細菌內毒素和真菌葡聚糖檢測。但由于該試驗是一種基于鱟試劑中的酶蛋白在模擬的生理環境下進行的反應,所以在反應過程中會受到很多生化因素的影響。此外,由于內毒素本身的特性決定了容易被吸附和集聚,所以細菌內毒素檢查時經常存在干擾問題。一項對人用藥物與鱟試驗相容性的研究證實了干擾的影響范圍,在所研究的品種中有70%的樣品是存在干擾的,僅有30%成分比較簡單的樣品(如注射用水)可以不經過任何處理直接進行BET。因此采取一些適當的方法處理這些干擾問題,從而減少實驗誤差,確保檢驗結果的準確性和疫苗、藥品的的安全使用就顯得非常重要。以下就對細菌內毒素檢驗中常見的干擾類型和消除方法進行簡要介紹。


      1.《中國獸典藥》(2015年版)規定無干擾的條件

      使用鱟試驗方法對任何樣品檢查前,必須充分驗證該樣品對試驗無干擾作用,這樣檢測結果才視為有效。

      1.1 凝膠法

      當溶液A(供試品溶液)和溶液D(陰性對照)的所有平行管都為陰性,并且系列溶液C(含2λ、λ、1/2λ、1/4λ內毒素標準品溶液)的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗時,試驗方為有效。

      當系列溶液B的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗時,認為供試品在該濃度下無干擾作用。


      1. 2 光度測定法

      供試品溶液回收率在50%~200%為無干擾;回收率<50%為抑制;回收率>200%為增強。不僅可判斷是否有干擾,還可以判斷干擾的類型是抑制還是增強。


      2.干擾的表現

      2.1 抑制

      供試品的內毒素濃度≥2倍檢測試劑的靈敏度(凝膠法),但檢測結果仍為陰性(也稱假陰性);光度測定法供試品的內毒素檢測值小于實際值(回收率<50%),稱之為抑制。

      抑制的結果使得內毒素不合格的原輔料用于生產、中間品進入下一道工序,潛在熱原的產品可能被放行到市場中,致使動物發病、死亡造成養殖戶的損失甚至重大動物疫苗質量事故。


      2.2 增強

      供試品含有的內毒素濃度低于檢測試劑的靈敏度1/2(凝膠法),但檢測結果仍為陽性(稱之為假陽性);光度測定法供試品的內毒素檢測值大于實際值(回收率>200%),稱之為為增強。

      增強的結果使得內毒素合格的原輔料不能用于生產、中間品不能進入下一道工序,直接導致產品報廢,造成很大浪費和不必要的經濟損失。


      3.干擾的因素

      來自樣品中的主成分、輔劑、甚至一些雜質,可能對鱟試劑或內毒素形成干擾。因為鱟試劑是一種酶,酶對反應環境有一些比較苛刻的條件,樣品中的成分如果影響到酶的活性,可能影響鱟試劑的活性而形成干擾。內毒素是高純度的脂多糖,樣品或其它試驗因素如果影響到內毒素的活性或影響內毒素的結構,也可以對鱟試驗產生抑制或增強作用。


      4.常見干擾的類型及處理

      4.1 pH值的干擾

      鱟試劑中的酶需要pH值在6~8范圍內才能達到最佳的反應活性,極端的pH環境會影響酶的活性或使酶失活,造成抑制,通常表現為假陰性。一般來說鱟試劑配方中都添加了緩沖對以幫助樣品的pH值的調節,如使用鱟試劑生產廠家的pH緩沖液,測定以1:1為比例的樣品稀釋液+鱟試劑的混合液,就可以將pH值為3的鹽酸調整為pH值為7。

      《中國獸典藥》2010年版要求“供試品溶液的pH值為6.0~8.0的范圍”,而在《中國獸典藥》2015年版改為“供試品和鱟試劑混合液的pH值為6.0~8.0的范圍”,這樣在描述上顯得更加科學。因此,在測試pH值時,應測定以1:1為比例混合的供試品稀釋液和鱟試劑混合溶液的pH值。

      但僅通過鱟試劑添加緩沖對并不足以解決所有樣品的pH值問題,若供試品本身具有極強的緩沖能力或樣品pH比較極端時,應采用以下方法進行pH的調節:

      ①用BET水(細菌內毒素檢測用水)嘗試在供試品允許的范圍內進行稀釋。

      ②用pH緩沖液如Tris(三羥甲基氨基甲烷)或Hepes(羥乙基哌嗪乙硫磺酸)制備或稀釋供試品。

      ③用酸(鹽酸)、堿(氫氧化鈉)或緩沖液來調節pH值。但酸、堿濃度不宜太高(最好不宜要超過0.1mol/L),因為酸、堿濃度太高會水解內毒素,對樣品本身內毒素造成破壞而形成新的干擾。


      4.2 二價陽離子濃度不足造成的干擾

      供試品中含有的螯合劑(如EDTA、檸檬酸鈉、肝素鈉、喹諾酮類藥物等)成分會螯合鱟試劑中的二價陽離子(如Mg2+離子),Mg2+是鱟試劑重要的輔因子,沒有Mg2+,內毒素就無法激活鱟試劑的酶,從而造成抑制,表現為假陰性。解決方法:①用BET水在供試品允許的范圍內進行稀釋。②使用含Mg2+離子或Ca2+離子的稀釋劑稀釋樣品,降低活性螯合劑的含量。但要注意過高的二價陽離子(如Ca2+)濃度可能會帶來新的干擾,形成抑制。


      4.3 高滲透壓帶來的干擾

      過高濃度的鹽或糖溶液通常會抑制鱟試劑反應,如50%的葡萄糖或5%的氯化鈉溶液。高滲透壓的溶液會從鱟試劑吸水,從而使酶失活,造成抑制,形成假陰性反應。

      解決方法:①用BET水的在供試品允許的范圍內進行稀釋可消除干擾。②5%的氯化鈉溶液可稀釋成生理鹽水(0.9%)后進行檢測。


      4.4 酶、酶抑制劑帶來的干擾

      鱟試劑的凝固酶屬于一種絲氨酸蛋白酶,供試品中若含有類似的絲氨酸蛋白酶(常見于血液制品)會導致激活鱟試劑的反應,造成增強,形成假陽性反應。

      一些人血漿制品(如人血白蛋白、靜注用IgG等),作為原料的血漿和血清中的絲氨酸蛋白酶抑制劑會抑制LAL凝固酶與內毒素的活性反應,造成抑制,形成假陰性反應。

      對酶、酶抑制劑帶來的干擾較為簡單的一種消除干擾的方法是:將供試品用BET水稀釋10倍,然后使用75℃加熱10分鐘,使其中的酶或蛋白失活。但要注意該方法對血液制品有用,但并不是對所有的樣品都適應。


      4.5 內毒素聚集造成的干擾

      內毒素標準品是提純的內毒素,是高純度的脂多糖、雜質很少,因此沒有自然存在的內毒素穩定(環境內毒素除含有內毒素脂多糖之外,還有一些細胞碎片、糖蛋白、脂類的包裹而非常穩定),溶解后放置時間太長,會失活造成效價下降;內毒素分子的兩親性又使其容易自身聚集成團,成為更大的分子,三維結構改變也會導致其效價下降,造成抑制。

      解決方法:

      ①按內毒素標準品說明書要求制備新鮮標準品溶液。

      ②如果內毒素標準品需要儲存,必須驗證其儲存條件是否會影響其活性。有些進口內毒素溶解后在可在原瓶2~8℃放置28天。

      ③經常旋渦含有標準內毒素的溶液,比如10分鐘旋渦一次。供試品和標準品每次稀釋或加樣時,均要旋渦至少30秒。


      4.6 脂質體的干擾

      脂多糖的兩親性會使其對一些具有疏水集團的產品具有親和力(如脂類、磷脂、脂蛋白、大分子量血漿蛋白),脂多糖與這些產品的結合會使其大小和形狀受到影響,以至于影響活性,使內毒素試驗受到干擾,形成抑制。

      解決方法:使用內毒素分散劑(如高聚磷酸酯活性劑)稀釋樣品可以使內毒素從供試品中分離出來,恢復內毒素的活性。


      4.7 內毒素吸附的干擾

      不是任何器具都適用于內毒素檢測,一些試驗器具(如塑料制品)會對內毒素有吸附作用而造成抑制。因此應首選硼硅酸鹽玻璃的稀釋管、反應管、刻度吸管,一次性器具應選擇聚苯乙烯,盡可能不要用聚丙烯材料,它會加劇內毒素的損耗(吸附內毒素)。同還要提防有些塑料包裝溶出物帶來的干擾。


      4.8 非內毒素反應物(LAL-RM)的干擾

      非內毒素反應物(LAL-RM)不是內毒素,不會引起熱原反應,但它會激活鱟試劑中的G因子形成反應,造成假陽性,形成增強。β-葡聚糖是造成鱟試驗結果假陽性的一個已知來源。日常使用的酒精棉、紗布、濾膜、纖維素類制品等都會帶來含有β-葡聚糖的成分。

      用鱟試劑生產廠家的抗增液復溶鱟試劑可以消除大多數的葡聚糖干擾。


      4.9 洗滌劑(表面活性劑)帶來的干擾

      無論是生產工藝上使用的洗滌劑(表面活性劑),還是試驗器具上殘留的洗滌劑都會對鱟試驗造成干擾。不僅會作用于鱟試劑,也會作用于內毒素;有可能帶來抑制,也有可能形成抑制。

      高濃度的洗滌劑使鱟試劑的蛋白變性,失去活性,形成抑制。

      某些洗滌劑(如脫氧膽酸)會將內毒素分散為脂多糖的單體(約20.000道爾頓),這些單體是無毒性并且不會激活鱟試劑,但去除洗滌劑后,內毒素活性恢復。

      弱的非離子型表面活性劑(比如吐溫-20或吐溫-80等),和其它陽離子洗滌劑會分解內毒素的三維結構,內毒素變成小分子,毒性中心暴露面積增加從而增加其效價,形成增強作用。

      解決洗滌劑、表面活性劑問題:

      ①用大量的水徹底清洗器具,確保器具無洗滌劑殘留。

      ②用BET水在允許范圍內對供試品進行更大倍數稀釋。

      ③試驗用生理鹽水稀釋供試品,生理鹽水可使供試品鹽化,從而降低其表面活性。

      以上介紹了內毒素檢驗時常見的干擾因素和處理方法,以及干擾對檢驗結果的影響。在實際檢測工作中,干擾并不是某一個因素,有可能種類更多。由于口蹄疫疫苗生產需要通過細胞培養、病毒繁殖、濃縮、純化、滅活、乳化、分裝等繁瑣的工藝過程,而且需要控制新生牛血清、細胞培養基等原輔材料以及注射用水,中間品、成品疫苗的細菌內毒素含量,樣品種類繁多、成分復雜,干擾的來源和影響也更為廣泛。因此,在建立這些樣品細菌內毒素檢測方法時,一定要按照《中國獸典藥》2015年版進行干擾試驗,同時要要注意消除干擾不能影響供試品中的內毒素,要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗,充分驗證該樣品對試驗無干擾作用后,才可用于樣品的檢測。對每次檢測的結果,無論是凝膠法還是光度法檢測,都要仔細分析,尤其對異常結果更要慎重對待,及時排除假陰性、假陽性、以及光度法中回收率不符合規定的結果,排除各種干擾后再進行檢測。最好的排除干擾的方法就是用細菌內毒素檢測用水對樣品進行更大的稀釋(但不能超過最大稀釋倍數),據報道有97%的干擾問題是可以通過稀釋供試品的方法去消除。如果各種措施都不能排除干擾,說明該樣品不適合用鱟試驗法檢測,可用家兔法或其它方法檢測。

      中農威特質量管理部 ?韋雪玲 ? 編審 ?李克斌



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